丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點:
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物,沒有或很少帶有離子的側(cè)基,因而電滲作用比較小,不易和樣品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì),在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比,形成 不同程度交鏈結(jié)構(gòu),其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化,可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子 的大小,選擇合適的凝膠成分,使之既有適宜的空隙度,又有比較好的機械性質(zhì)。一 般說來,含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠,機械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物 質(zhì),1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠,而分子量特別大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝膠,大孔膠易碎,小孔膠則難從管中取出,因此當丙烯酰胺的濃度增 加時可以減少雙含丙烯酰胺,以改進凝膠的機械性能。
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明,易觀察,可用檢測儀直接測定。
④丙烯酰胺是比較純的化合物,可以精制,減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體,甲撐雙 丙烯酰胺稱交聯(lián)劑,在水溶液中,單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應形成凝 膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應過程中,需要有催化劑參加,催化劑包括引發(fā)劑和 另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基,通過自由基的傳遞,使丙烯酰胺 成為自由基,發(fā)動聚合反應,加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表:
聚合反應催化劑配伍
引 發(fā) 劑 加 速 劑
(NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8 DMAPN
核 黃 素 TEMED
注:(NH4)2S2O8,過硫酸胺 TEMED:N,N,N,N';四甲基乙二胺 DMAPN:β-二甲基胺基丙晴 用過硫酸銨引發(fā)的反應稱化學聚合反應;用核黃素引發(fā),需要強光照射反應液, 稱光聚合反應。 聚丙烯酰胺聚合反應可受下列因素影響: 1、大氣中氧能淬滅自由基,使聚合反應終止,所以在聚合過程中要使反應液與空氣 隔絕。 2、某些材料如有機玻璃,能抑制聚合反應。 3、某些化學藥物可以減慢反應速度,如赤血鹽。 4、溫度高聚合快,溫度低聚合慢。 以上幾點在制備凝膠時必須加以注意。 凝膠的篩孔,機械強度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度,常用T%表達;凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度,常用C%表示,可用下式計算:
公 式
a:丙烯酰胺克數(shù); b:甲撐雙丙烯酰胺克數(shù);m:緩沖液體積(毫升) 凝膠濃度過高時,凝膠硬而脆,容易破碎;凝膠濃度太低時,凝膠稀軟,不易操作。
交聯(lián)度過高,膠不透明并缺乏彈性;交聯(lián)度過低,凝膠呈糊狀。 聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度,它不防止對流減低擴散的能力,而且因為它具有三 度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大 小和形狀,這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用,這里的凝膠并不僅是單純 的支持物,因此,在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外,還必須注意與凝膠本 身有關的各種性質(zhì)(網(wǎng)孔的大小和形狀等)。可通過下式計算來選擇適當?shù)哪z網(wǎng) 孔。
公 式
式中:P為網(wǎng)孔平均直徑,C為多聚體濃度,d為該多聚體分子直徑(若不是卷曲的分 子應為),K為常數(shù),K值取決于漲膠的幾何構(gòu)型,假如多聚體的鏈是以近似于直角 交聯(lián)的,則約為1.5根據(jù)此式,我們可以通過多聚體濃度C近似地計算出網(wǎng)孔直徑,例 如已知多聚體濃度為5%,其網(wǎng)孔平均直徑應為:
公 式
這樣的計算是粗略的,與實際情況有一定距離,有人測定了總濃度(T)為20%的丙烯酰胺液,在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下,聚合后的網(wǎng)孔大小,發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關,總濃度愈大,孔徑相應變小,機械 強度增強,與總濃度不變時,甲叉雙丙烯酰胺(Bis)的濃度在5%時孔徑小,高于或 低于此值時,聚合體孔徑都相對變大,凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數(shù),它 往往決定了電泳的分離效果。經(jīng)過不斷的實踐,得到了如表3所示的經(jīng)驗值,在一般情況下,大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃 度的凝膠,所得電泳結(jié)果往往是滿意的,因此稱由此濃度組成的凝膠為“標準凝 膠”。
對那些用于重要研究的凝膠,好是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進行預先試驗,以選出適凝膠濃度。
表3
不同分子量范圍的蛋白質(zhì)和核酸在凝膠電泳 中所選用的凝膠濃度百分率
物 質(zhì) 分子量范圍 適用的凝膠濃度(%)
蛋白質(zhì) <10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
核酸 <104 104-105 105-2×106 10-20 5-10 2-3.6
聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類,前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液,pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的,后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液,pH值和孔徑,不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層,從而提高分辨 能力。
蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除,那電泳遷移率就取決于分子的大 小,就可以用電泳技術測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年,Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉(SDS)具有這種作用。當向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇,SDS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電,使各種蛋白 質(zhì)—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷,它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量, 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后,還可引起構(gòu)象改 變,蛋白質(zhì)—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒,不同蛋白質(zhì)的SDS復合物 的短軸長度都不一樣,約為18A,這樣的蛋白質(zhì)—SDS復合物,在凝膠中的遷移率,不 再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響,而取決于分子量的大小,因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。