Northern blot技術(shù)

經(jīng)乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進(jìn)行的RNA電泳

　　這一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。 含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進(jìn)行電泳， 因?yàn)榍罢哂緞?dòng)速率較慢而且需將電泳液時(shí)行循環(huán)以避免電泳過(guò)程中形成過(guò)高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝膠對(duì)RNA進(jìn)行分級(jí)離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。
1）在滅菌的微理離心管內(nèi)，混勻下列液體：
6mol/L乙二醛 5.4μl
DMSO 16.0μl
0.1mol/L磷酸（pH7.0） 3.0μl
    RNA（多達(dá)10μl） 5.4μl市售乙二醛通常為40％溶液（6mol/L）。 由于接觸空氣的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通過(guò)混合床樹(shù)脂（Bio-Rad AG 501-X8 對(duì)乙三醛溶液進(jìn)行去離子處理，直至溶液pH值大于5.0為止，然后可分裝在小份， 用蓋緊的小管貯存于－20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液體應(yīng)予丟棄。0.1mol/L磷酸鈉（pH7. 0）的配法如下：將3.9ml 1mol/L磷酸二氫鈉、6.1ml 1mol/L磷酸氫二鈉和90ml 水混合，用DEPC處理上述溶液后高壓滅菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1％以上），如等測(cè)RNA含量極微，每個(gè)泳道應(yīng)加0.5-3.0μg poly（A）+RNA。
2）將微量離心管蓋嚴(yán)，將RNA溶液置于％0℃溫育50℃溫育60分鐘后， 用冰水浴冷卻樣品，離心5秒鐘，使管內(nèi)所有液體沉降至管底。
3）于50℃溫育RNA溶液的同時(shí)，灌制瓊脂糖水平凝膠，用1.4 ％瓊脂糖分析1kb 以下的RNA樣品， 而用1％瓊脂糖分析1kb 以上的RNA樣品。 用0mmol/L 磷酸鈉（pH7. 0 ）后， 降溫至70 ℃， 加入碘乙酸鈉固體至終濃度為10mmol/L（使RNA酶失活），再降溫至50℃，制膠，加入RNA樣品前一至少放置30分鐘使其凝固。用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈，用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％H2O2，于室溫放置10分鐘后，用經(jīng)DEPC處理的水*沖洗電泳槽。因乙二醛可與溴化乙錠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所以制膠和電泳過(guò)程中誚避免作用溴化乙錠。
4）將RNA樣品冷卻至0℃，加入4μl 滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的戊二醛－DMSO凝膠中樣緩沖液，隨后立即將上述樣品加至凝膠加樣孔。用已知大小的乙醛酰RNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA長(zhǎng)度分別為6322、2366和710個(gè)堿基。也可以從BRL購(gòu)置已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色，可能的話應(yīng)在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留空一個(gè)泳道。
乙二醛－DMSO凝膠加樣緩沖液
50％甘油
10mmol/L磷酸鈉（pH7.0）
0.25％溴酚藍(lán)
0.25％二甲苯青FF
5）將凝膠浸入10mmol/L磷酸鈉電泳液中，以3－4V/cm電壓降進(jìn)行電泳，同時(shí)按圖7.1對(duì)磷酸鈉容液時(shí)行持續(xù)再循環(huán)，使溶液pH值維持在可被接受的限度 內(nèi)（pH>8.0時(shí)乙二醛將從PNA分子上解離）。另一方法為電泳時(shí)每30分鐘換一次磷酸鈉緩沖液。
6）電泳結(jié)束后（溴酚藍(lán)遷移出區(qū)8cm），切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠條，浸入溴化憶錠溶液（0.5μg/ml，
    用0.1mol/L乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠放置一透明遲，在紫外燈下照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離，以RPN片段大小的lg對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計(jì)算從凝膠移到固相支持體后通過(guò)雜交檢出的RNA分子的大小。
7）RNA從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
將變性RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜
　　電泳完畢后，可立即將乙醛酰RNA自瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，有以下幾種轉(zhuǎn)移方法：毛細(xì)管洗脫法、真空轉(zhuǎn)移法和電印跡法。毛細(xì)管洗脫法如下所述， 真空轉(zhuǎn)移法和印跡法則按有關(guān)儀器生產(chǎn)廠家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。盡管有人認(rèn)為在轉(zhuǎn)移前對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行預(yù)處理實(shí)屬不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），
    但我們認(rèn)為含甲醛的凝膠必須用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次，除去甲醛。 如果瓊脂糖中濃度大于1％或凝膠厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氫氧化納浸泡凝膠20分鐘。 然后在凝膠上放置硝酸纖維素凝膜或尼龍膜，RNA隨向上遷移的緩沖液轉(zhuǎn)移至固相支持體（硝酸纖維素濾膜或尼龍膜）上。
1）將凝膠移至一個(gè)玻璃皿內(nèi)，用鋒利刀片修凝膠的無(wú)用部分，在凝膠左上角（加樣孔一端為上）切去一角，以作為下列操作過(guò)程中凝膠方位的標(biāo)記。
2）用長(zhǎng)和寬均大于凝膠的一塊Plexiglas有機(jī)玻璃或一疊玻璃板作為平臺(tái)，將其放入大千烤皿內(nèi)，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20xSSC使液面略低于平臺(tái)表面，當(dāng)平上方的3MM濾紙溫透后，用玻棒趕出所有的氣泡。
3）用一把新的解剖刀或切紙刀裁一張硝酸纖維素濾膜（Schleicher ＆Schuell BA85或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品）。濾膜的長(zhǎng)度和寬度應(yīng)分別比凝膠大1mm， 接觸濾膜時(shí)須戴手套或用平頭鑷子（例如Millipore鑷子），用有油膩的手接觸過(guò)的硝酸纖維素濾膜不易浸溫。
4）將硝酸纖維素濾膜浮在去離子水表面，直至濾膜從下向上濕透為止，隨后用20xSSC浸泡濾膜至少5分鐘，用干凈的解剖刀片切去濾膜一角， 使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)。不同批號(hào)的硝酸纖維膜，其浸濕速率相差懸殊。如濾膜池浮在水面上幾分鐘后仍未濕透，應(yīng)另?yè)Q一張新濾膜，因?yàn)槲淳鶆蚪竦臑V膜進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移是靠不住的。這種濾膜也不必丟棄，可將其夾在用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間， 高壓5分鐘。通常上述處理足以使硝酸纖維素濾膜濕透。高壓處理的濾膜應(yīng)夾在經(jīng)過(guò)高壓理理并用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間，裝入塑料袋， 密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?br />5）將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上溫潤(rùn)的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠這間不能滯留氣泡。
6）用Saran包裝膜或Parafilm膜圍繞凝膠周邊，但不是覆蓋凝膠， 以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至凝膠上方的紙巾層中。并非堆放得十分整齊的紙巾，易于從凝膠的邊緣垂下并與平臺(tái)接觸，這種液流的短路是導(dǎo)致凝膠中的RNA的轉(zhuǎn)移效率下降的主要原因。
7）在凝膠上方放置溫潤(rùn)的硝酸纖維素濾膜，并使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應(yīng)剛好超過(guò)凝膠上部加樣孔一線的邊緣。濾膜置于凝膠表面適當(dāng)位置后，就不應(yīng)輕易移動(dòng)，濾膜與凝交之間不應(yīng)留有氣泡。
8）用2xSSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的3MM濾紙， 溫潤(rùn)的放置在濕潤(rùn)的硝酸纖維濾膜上方。用玻璃棒趕出其間滯留的氣泡。
9）切一疊（5－8cm高）略小于3MM濾紙的紙巾，將其放置在3MM濾紙的上方。并在紙巾上方放一塊越境玻璃板，然后用－500g的重物壓實(shí)。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向硝酸纖維素濾膜的上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在硝酸纖維素濾膜上。
10）使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進(jìn)行6－18小時(shí)，每當(dāng)紙巾浸濕后，應(yīng)換凝的紙巾。
11）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙，翻轉(zhuǎn)凝膠和硝酸纖維素濾膜，以凝膠的一面在上，置于一張干的3MM濾約紙上，用一支極軟鉛筆或圓珠筆，在濾膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置。
12）從硝酸纖維素濾膜上剝離凝膠棄之。以6x SSC溶液于室溫浸泡濾膜5分鐘，這一步可以除去粘著在濾膜上的瓊脂糖碎片。從6xSSC溶液中取出濾膜，將濾膜上的溶液滴盡后平放在一張紙巾上。于室溫晾干30分鐘以上。為估計(jì)RNA的轉(zhuǎn)移效率， 可將膠置于溴化乙錠溶液（0. 5 μg/ml ， 以0.1mol/L乙酸銨配制）中染色45分鐘，于紫外燈下觀察。
13）將晾干的濾膜放在兩經(jīng)張3MM濾紙中間，用真空爐于80℃干烤0.5-2 小時(shí)。如干烤時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，濾膜極易脆裂并可能發(fā)黃。如果濾膜并不立即用于雜交實(shí)驗(yàn)，可用鋁箔寬松地包裹起來(lái)，在真空下貯存于室溫。
14）僅適用于濾膜上含有乙醛酰PNA的情況：雜交前需用20mmol/L Tris.Cl（pH8.0）于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。
（三）轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜前后進(jìn)行的ＲＮＡ染色
當(dāng)ＲＮＡ自瓊糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之前，溴化乙錠的染色時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，這是因?yàn)楸蝗玖巷柡偷暮怂岱肿樱滢D(zhuǎn)移效率有所降低。然而，用溴化乙錠作短暫染色，既不至于對(duì)核酸轉(zhuǎn)移過(guò)程產(chǎn)生可以察覺(jué)的掏作用，又*同時(shí)檢測(cè)凝膠和凝膜上的ＲＮＡ的優(yōu)點(diǎn)。
１．方法Ｉ
１）電泳結(jié)束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝膠應(yīng)浸入含溴化乙錠（0.5 μg/ml）的10mmol/L磷酸鈉（pH7.0）溶液。甲醛凝膠需用無(wú)ＲＮＡ酶的水淋洗，用20xＳＳＣ溶液浸泡，隨后用含溴化乙錠（0.5μg/ml）的20x
ＳＳＣ溶液染色。
２）于室溫染色５－１０分鐘，在紫外燈下觀察，照像。
３）按前所述方法， 將凝膠中的ＲＮＡ轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，轉(zhuǎn)移后能常在學(xué)光下也可看出已染色的ＲＮＡ條帶。
這種方法僅適用于每一泳道均含有相當(dāng)大量（如５μg 以上）的ＲＮＡ的情況。
２．方法Ⅱ
　　硝酸纖維素濾膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：從干烤后的硝酸纖維素濾膜上剪下所需的條帶進(jìn)行染色，也可以用經(jīng)過(guò)雜交并經(jīng)Ｘ光片曝光后的整張濾膜進(jìn)行染色（Ａ.Ｅfstratiadis,未了表材料）。
１）將干燥的濾膜浸入５％冰乙酸中，于室溫浸泡15分鐘。
２）再將濾膜轉(zhuǎn)移至0.5mol/L乙酸鈉（pH5.2）、0.04％亞甲藍(lán)溶液中， 于室溫浸泡５－１０分鐘。
３）用水淋洗濾膜５－１０分鐘后，可見(jiàn)ＲＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物帶型銳利而poly（A）+mRNA為一模糊帶型，由許多長(zhǎng)度范圍從500堿基以下至５kb以上的各種mＲＮＡ共同組成，mＲＮＡ的平均長(zhǎng)度約為２kb。
雜交和放射自顯影
　　固定于濾膜上的RNA的預(yù)雜交、雜膠及淋洗等條件，與DNA雜交的相應(yīng)條件基本相同。現(xiàn)簡(jiǎn)述如下1）用下列兩種溶液之一進(jìn)行預(yù)雜交，時(shí)間1－2小時(shí)。若于42℃進(jìn)行，應(yīng)采用。
50％甲酰胺
5xSSPE
2xDenhardt試劑
0.1％SDS
若于68℃進(jìn)行，應(yīng)采用：
6xSSC
2xDenhardt試劑
0.1％SDS
2）在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標(biāo)記探針，如欲檢測(cè)低豐度mRNA， 所用探針的量至少為0.1μg，其放射性比活度應(yīng)大于2x108計(jì)數(shù)/（分．μg）在適宜的溫度條件下繼續(xù)溫育16-24小時(shí)。切記RNA只與雙鏈DNA中一條單鏈互補(bǔ)，因此如用單鏈探針， 則必須是能與RNA互補(bǔ)的一條單鏈。
3）用1xSSC、0.1％SDS于室溫洗漠20分鐘， 隨后用0.2xSSX、 0.1％SDS于68℃洗膜3次每次20分鐘。
4）用X光片（Kodak XAR－2或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品）進(jìn)行放射自顯影， 附加增感屏于－17℃曝光24-48小時(shí)。