植物組織RNA提取
從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析,純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫,RT-PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究,都需要高質(zhì)量的RNA。因此,從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關(guān)鍵所在。 a )*Y(WL
從文獻報道上看,有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA, 而阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進展。一般認為在這些植物組織中,或富含酚類化合物,或富含多糖,或含有某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物,或RNase的活性較高。在完整的細胞內(nèi)這些物質(zhì)在空間上與核酸是分離的,但當組織被研磨,細胞破碎后,這些物質(zhì)就會與RNA相互作用。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆地結(jié)合,導(dǎo)致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失[1],或形成不溶性復(fù)合物[2];而多糖會形成難溶的膠狀物,與RNA共沉淀下來[3];萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學(xué)降解[2]和酶解。對于這些植物材料,用常規(guī)的RNA提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基*基溴化胺法等)難以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常規(guī)的方法提取芒果果實的RNA時未能成功,他們的結(jié)果分為三種情況:提出的RNA已被降解;RNA的得率很低;得到的RNA不能進行體外翻譯。他們認為在果實成熟時各種酶的活性增強,其中也包含RNase,不溶性的淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性的多糖,芒果果實細胞壁中特殊的成份,以及果實中高含量的多酚化合物都是干擾RNA提取的因素[4]。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果實的RNA時,發(fā)現(xiàn)RNA與某種未知化合物凝聚成不溶性的復(fù)合物,并且這種未知化合物在230nm和270nm處有強的光吸收,從而干擾了RNA紫外吸收的測定[5]。因此能否有效地去除多糖、酚類化合物、RNase和干擾RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。本文根據(jù)文獻綜述了解決上述植物RNA提取過程中難點的相應(yīng)對策。 zL[=OZw^
1 酚類化合物的干擾及對策 TG$GZ(N1
許多植物組織特別是植物的果實(如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等)[6]和樹木類植物中[1]富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外,針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多[1]。在植物材料勻漿時,酚類物質(zhì)會釋放出來,氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深,這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)(browning effect)[7]。被氧化的酚類化合物(如醌類)能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合,從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性,因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)(如原花色素類物質(zhì))是影響RNA提取的一類化合物[8]。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化,然后再將其與RNA分開。 cHlu yS-fF
1.1 防止酚類化合物被氧化的方法 pU$IH*\\| 2
還原劑法:一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)或半胱氨酸[9]來防止酚類物質(zhì)被氧化,有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2%[10]。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉淀RNA時加入(-巰基乙醇(終濃度1%)可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉(NaBH4)是一種可還原醌的還原劑,用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減,醌類化合物可被還原成多酚化合物[7]。 _K8])G,
螯合劑法:螯合劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力,其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基,因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物,使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化,并可以在以后的抽提步驟中被除去[6]。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素,在pH8.0以上時PVP結(jié)合多酚的能力會迅速降低[11]。當原花色素類物質(zhì)量較大時,單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物,因而需要與其它方法結(jié)合使用[6]。 \\~/)UyuSH
Tris-硼酸法:如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸(pH7.5),其中的硼酸可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物,從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效,所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑[4]。但如果Tris-硼酸濃度過高(>0.2M)則會影響RNA的回收率[7]。 *59AzmK
牛血清白蛋白(BSA)法:原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原-抗體間的相互作用,形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物,減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機會,因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase,因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性[6]。 -yR#,S_0
丙酮法:Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料,可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA[1]。 s4 q_!qz
Guillemant等[12]和Ainsworth[13]認為低pH值(pH5.5)的提取緩沖液可以防止酚類化合物的離子化和進一步的氧化。 ;aX0At6
1.2 酚類化合物的去除 uQU)zmZZ3U
通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚,可以直接通過離心去除掉,或在苯酚、氯仿抽提時除去[6]。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇(50%)來沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50% 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化,其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除,無需再用NaBH4來處理[14]。 }#Y?Wr
2 多糖的干擾及對策 R:Q=MFV
多糖的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多糖,而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似,因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了,造成RNA產(chǎn)量的減少;而在沉淀RNA時,也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀,這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水,或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性[15],因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中,通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖;在高濃度Na+或K+離子存在條件下,通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中[7]。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當多的多糖與RNA混雜在一起[13],所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。 Mqr-s9N
用低濃度乙醇沉淀多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10%~30%,可以使多糖沉淀下來,而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇,如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時,在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10%以沉淀多糖[3]。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時,是在用CsCl超離心,乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30%乙醇來沉淀多糖的,進一步純化了RNA樣品[5]。 l 1E<*$
另一個常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀(pH4.8)溶液以沉淀多糖[9];Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀(pH4.8)溶液[13]。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的8.5M醋酸鉀(pH6.5)溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)[16]。在提取某些植物材料的RNA時,是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時,是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)[4]。Su等在去除褐藻的多糖時,單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效,只有兩者結(jié)合使用效果佳[7]。 G>5 '8
Fang等認為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖[15]。Chang等在提取松樹RNA時,緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M,通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離[10]。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋,調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM,然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖[14]。 `0xoS54Vh
3 蛋白雜質(zhì)的影響及對策 '%#3L
蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì),因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性;提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑,如苯酚、胍、SDS、十六烷基*基溴化銨(CTAB)等,這樣在勻漿時可以使蛋白質(zhì)變性,凝聚;有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。 `W`*r0^Xj
Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70%高氯酸鈉溶液中,RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度,因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇,這時RNA能沉淀下來而能溶于70%高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)[17]。 yWv>g$
4 次級代謝產(chǎn)物的影響及對策 'S|xat8NjL
從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物,這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì),所以,目前還沒有什么特殊的方法來解決這個問題。Baker等[18]綜合Hughes等[16]的選擇性沉淀法、Chirgwin[19]的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。 MT^#tP;I
由于植物組織特別是高等植物組織細胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性,使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實踐中經(jīng)常會發(fā)現(xiàn),即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同;含有某種干擾因素的不同植物材料,其適用的RNA提取方法可能不同;即使是同一種植物同一種組織材料,但來源于不同基因型植株,其RNA提取方法也可能不一樣。所以,對于某一植物或其組織來說,其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實踐才能確立。 PhS e%-a
隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬,可以肯定地說,在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過程中還會出現(xiàn)新的難點,但隨著不斷地探索和經(jīng)驗的積累,科學(xué)工作者們一定會迅速地解決這些難點,為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。