影響質(zhì)粒提取的因素
影響質(zhì)粒提取的因素:
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān),如宿主菌的種類和培養(yǎng)
條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)??截悢?shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。
宿主菌種類
質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,多數(shù)情況下我們是
從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的
質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖
類,如果沒有*去除,將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性,影響質(zhì)粒
DNA提取的質(zhì)量。另外,有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性,會(huì)降低
DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA。
培養(yǎng)時(shí)間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落,接種到培養(yǎng)物中(含有相關(guān)抗生
素的液體培養(yǎng)基中),振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。不應(yīng)超過16小時(shí),因?yàn)檫@時(shí)
細(xì)胞開始裂解,使得質(zhì)粒的得率降低,也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
質(zhì)粒擴(kuò)增
氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,但對松弛型質(zhì)粒的
復(fù)制沒有影響。因此,在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)
粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,
從而抑制了染色體的復(fù)制,但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長,故質(zhì)
粒仍可繼續(xù)復(fù)制,這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量,又可降低細(xì)胞的數(shù)量,
使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴(kuò)增的氯霉素濃度為
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生長階段都應(yīng)加入抗生素篩選?,F(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不
含有在細(xì)胞分裂時(shí)確保平均分配的par位點(diǎn),無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無
抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。