RNA評(píng)價(jià)與鑒定

RNA評(píng)價(jià)與鑒定
提取得到RNA溶液后，我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)，以確
定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)
量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整且無(wú)酶等抑制物殘
留；Northern blot實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘
留要求較低；RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)
抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法
純化RNA，以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果。
RNA得率檢測(cè)——分光光度計(jì)法
RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的
難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來(lái)說(shuō)，可通過(guò)分光
光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm處的吸光值來(lái)計(jì)算RNA的含量。RNA
溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液
渾濁度、雜質(zhì)（多肽、苯酚等）濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)
準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025（光
程為1cm），即OD260=1時(shí)，樣品中RNA濃度為40μg/ml。通常分光
光度計(jì)OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的，因此RNA提
取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計(jì)
檢測(cè)。按下面的公式計(jì)算總RNA濃度：
總RNA濃度（μg/ml）= OD260×稀釋倍數(shù)× 40μg/ml
RNA純度檢測(cè)——分光光度計(jì)法
通過(guò)OD260/280來(lái)檢測(cè)RNA純度，OD260/230作為參考值。
OD260/280在1.9-2.1之間，可以認(rèn)為RNA的純度較好；
OD260/280值小于1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；
OD260/280值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；
OD260/230值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙
醇?xì)埩簟?br />注意：如果用TE溶解或洗脫RNA，會(huì)使OD260/280值偏大。
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳：
我們可以通過(guò)RNA變性電泳，來(lái)鑒定RNA的完整性，但一般情況
下常規(guī)電泳檢測(cè)即可。
RNA變性電泳方法如下：
1、凝膠制備：1.2％瓊脂糖凝膠
2、上樣電泳
①電泳混合液的制備：
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37％甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μ l甲醛凝膠上樣緩沖液，混合后離心5秒
⑥將樣品加入點(diǎn)樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳至溴酚藍(lán)帶跑到電泳槽中央（20cm長(zhǎng)電
泳槽，95V電壓，1小時(shí)左右）。
rRNA占總RNA的80-85％，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到
28S（23S）和18S（16S）rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩
倍，說(shuō)明RNA完整性較好。
常規(guī)電泳：
由于變性電泳操作步驟較為復(fù)雜，所以在要求不太嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)
中，RNA的檢測(cè)可以通過(guò)常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。一般1％
左右的凝膠就可以。按常規(guī)電泳配制好凝膠和電泳溶液，總RNA
在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致。