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用于檢測(cè)未知抗體的間接法

更新時(shí)間:2012-06-04  |  點(diǎn)擊率:3407

  用于檢測(cè)未知抗體的間接法:

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml, 每孔加0.1ml,
4℃過夜。次日洗滌3次。
              ↓
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,
置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照) 于反
應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育
30-60分鐘,洗滌,后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
操作要點(diǎn):
1 標(biāo)本的準(zhǔn)備
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾
液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體
或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液),有些
則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾
水或去離子水,包括用于洗滌的鹽,應(yīng)為新鮮和高品質(zhì)的。自配的
緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與
室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱
保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物。
加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并
注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。
加標(biāo)本一般用微量加樣器,按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)
更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染。有時(shí)測(cè)定(如間接法ELISA)需用稀
釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔
中加入稀釋液,再在其中加入血清標(biāo)本,然后在微型震蕩器上震蕩
1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合液和底物反應(yīng)液時(shí)可用定量多道加液
器,使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。
抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,這一保溫過程稱為
溫育。
ELISA屬固相免疫測(cè)定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。
以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標(biāo)本,其中的抗原并不是
都有均等的和固相抗體結(jié)合的機(jī)會(huì),只有貼近孔壁的一層溶液中
的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴(kuò)散
才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合
也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃
是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫
度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí),實(shí)驗(yàn)表明,兩次抗原
抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反
應(yīng),可提高反應(yīng)的溫度,有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行,但不宜采用更高的
溫度??乖贵w反應(yīng)4℃更為*,在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在
冰箱中過夜,以形成多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng),在ELISA中
一般不予采用。
保溫的方式除某些ELISA儀附有特制的電熱塊外,一般均采用水
浴,可將ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底應(yīng)貼著水面,使溫度
迅速平衡。為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮
膜覆蓋板孔,此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA
板應(yīng)放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底
墊濕的紗布,后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱
中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無論是
水浴還是濕盒溫育,反應(yīng)板均不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅
速平衡。室溫溫育的反應(yīng),操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍
內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要
求控制溫育。室溫溫育時(shí),ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)
注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成
敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目
的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物
質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚
苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種
非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來??梢哉f在ELISA操作中,洗滌
是主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視,操作者應(yīng)嚴(yán)格按
要求洗滌,不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外,手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液;b.用洗滌液過洗一遍(將
洗滌液注滿板孔后,即甩去);c.浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置
1-2分鐘,間歇搖動(dòng),浸泡時(shí)間不可隨意縮短;d.吸干孔內(nèi)液體。
吸干應(yīng)*,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體后在清潔毛巾
或吸水紙上拍干;e.重復(fù)操作c和d,洗滌3-4次(或按說明規(guī)定)。在
間接法中如本底較高,可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。
6 顯色和比色
(1) 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成
有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間
內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適
當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中,加入底物后的反
應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行,
時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的
顯色情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,及時(shí)判斷。
OPD底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,再
延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色,
顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行,顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD
產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺(tái)上,邊反應(yīng)邊觀
察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)
果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達(dá),隨即逐漸減弱,
至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和
十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚
能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止
劑。此外,各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時(shí)可用特定
的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。
(2) 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放
入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),需先將板置于標(biāo)
準(zhǔn)96孔的座架中,才可進(jìn)行比色。好在加底物液顯色前,先將軟
板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。
比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn),測(cè)讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液
的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔),以記
錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn),以上各
孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進(jìn)行計(jì)算。
比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度(oplical density,OD),現(xiàn)按規(guī)定用
吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是,將吸
收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm,表示方
法為"A492nm"或"OD492nm"。
(3) 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀,通常指于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光
度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同,各有特制的適用于板、珠和小試
管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指
標(biāo)有:測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測(cè)范圍、
線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001,準(zhǔn)確性為±
1%,重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說,若某孔測(cè)得的A值為1.083,則該孔
相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01(1.073~1.093),重復(fù)測(cè)定
數(shù)次,其A值均應(yīng)1.083±0.05(1.078~1.088)在之間。酶標(biāo)儀的可
測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000,
新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900,甚至更高。超出可測(cè)上限的A
值常以"*"或"over"或其它符號(hào)表示。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的
不同,線性范圍常小于可測(cè)范圍,比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為
0.000~2.900,而其線性范圍僅0.000~2.000,這在定量ELISA中制
作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下,操
作時(shí)室溫宜在15~30℃,使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘,測(cè)讀結(jié)果
更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí),要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,如OPD用492nm
波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀,即每孔先后測(cè)讀兩次,*
次在適波長(zhǎng)(W1),第二次在不敏感波長(zhǎng)(W2),兩次測(cè)定間不移動(dòng)
ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1,630nm為W2,終測(cè)
得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃
痕或指印等造成的光干擾。各種酶標(biāo)儀性能有所不同,使用中應(yīng)詳
細(xì)閱讀說明書。

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