關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的研究
神經(jīng)干細(xì)胞的研究進展及前景展望
神經(jīng)組織的再生是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一,近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)的存在,但大部分NSC處于靜止?fàn)顟B(tài),從體內(nèi)分離、激活NSC,具有非常廣闊的生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用前景,已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病研究的焦點。本文擬就NSC研究的新進展及其應(yīng)用前景綜述如下。
1 NSC的分布
1992年Reynolds等[1]和Richards等[2]先后從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC,首先打破了成體哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)觀念。成體哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在兩個NSC聚集區(qū):側(cè)腦室壁的腦室下層(sub ventricular zone, SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(sub granular zone, SGZ)[3]。用免疫熒光標(biāo)記SVZ的干細(xì)胞,在活體可以清晰地觀察到增殖的細(xì)胞從腦室遷移到嗅球的軌跡[4];SGZ的干細(xì)胞則發(fā)育形成顆粒細(xì)胞,并與海馬齒狀回建立突觸[5]。在人胚NSC的研究,已從大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、腦室沿線包括側(cè)腦室、第三腦室和第四腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓、視網(wǎng)膜中分離得到NSC,或具有比NSC更明確發(fā)展方向的神經(jīng)祖細(xì)胞。
2 NSC的基本生物學(xué)特性
Mckay[6]于1997年提出,NSC是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力,能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。其生物學(xué)特性主要有以下幾方面。
2.1 自我更新 NSC具有高度增殖和自我更新以維持自身數(shù)目恒定的能力。通過兩種方式實現(xiàn),對稱分裂:干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的兩個子細(xì)胞都是干細(xì)胞;不對稱分裂:干細(xì)胞分裂產(chǎn)生一個干細(xì)胞和一個分化的子代細(xì)胞,后者終分化為終末細(xì)胞。NSC增殖,互相聚集成神經(jīng)球,根據(jù)大小和培養(yǎng)的時間,神經(jīng)球可含有NSC、正在分化的神經(jīng)前體細(xì)胞、凋亡細(xì)胞,甚至已分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等。NSC繼續(xù)增殖,則生長出許多子代的神經(jīng)球[7]。Vescovi等[8]報道,NSC可在體外持續(xù)傳代達(dá)3年以上,分裂后的子代干細(xì)胞具有與母代干細(xì)胞*相同的生物學(xué)特性。
2.2 多潛能分化 NSC分化后可形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,其分化與局部微環(huán)境密切相關(guān)。目前NSC的誘導(dǎo)分化可通過生長因子誘導(dǎo)、基因調(diào)控及信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)等途徑。
2.3 遷移功能和良好的組織融合性 在人類和哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中, NSC沿著發(fā)育索方向遷移。移植后的NSC同樣具有遷移能力,且受病變部位神經(jīng)源性信號的影響,移植后的NSC具有向病變部位遷移的趨化性,并分化成特異性細(xì)胞[9]。腦室內(nèi)移植的NSC可以通過血腦屏障,遷移至腦實質(zhì)中與宿主細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上形成初步良好的整合,參與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。
2.4 高度未分化狀態(tài)及低免疫原性 NSC增殖能力處于較原始的未分化狀態(tài),呈巢蛋白(nestin)陽性,缺乏已分化細(xì)胞的抗原標(biāo)志,無成熟細(xì)胞相應(yīng)的特異性標(biāo)志,不表達(dá)成熟細(xì)胞的抗原,具有低免疫原性,在移植后較少發(fā)生異體排斥反應(yīng),利于其存活[10]。
2.5 轉(zhuǎn)分化和去分化 Bjornson等[11]發(fā)現(xiàn)小鼠NSC植入同種異體血管內(nèi)可逆轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞。Clarke等[12]將Lac-z標(biāo)記的小鼠NSC移入雞和小鼠囊胚中,可逆轉(zhuǎn)分化成為內(nèi)中外3個胚層,經(jīng)研究證實利用NSC可實現(xiàn)跨胚層分化,如分化為骨骼肌細(xì)胞及造血系統(tǒng)的各系細(xì)胞等。但隨著研究的深入,越來越多的科學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)的事實和成體組織中存在成體干細(xì)胞的證據(jù),向“橫向分化”、“跨胚層分化”學(xué)說等提出質(zhì)疑, Nature(2004)刊登了兩個不同實驗室的2篇論著 [13,14],各自用充分的事實證明,輸注的CD34+造血干細(xì)胞到達(dá)損傷的心肌部位卻仍然分化為CD45+造血細(xì)胞,而沒有變?yōu)樾募〖?xì)胞的任何證據(jù)。
3 NSC的來源、分離、培養(yǎng)及鑒定
3.1 NSC的來源 NSC主要從以下幾種途徑獲得:(1)來源于神經(jīng)組織[15];(2)來源于胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞等細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化[16];(3)來源于血液系統(tǒng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞[17]、成年多能祖細(xì)胞[18]及臍血細(xì)胞[19];(4)來源于永生化細(xì)胞系 C17-2細(xì)胞系[20](由新生小鼠小腦外顆粒層細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)V-Myc后獲得的克隆多能干細(xì)胞系)、MHP36細(xì)胞系[21](從轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度敏感型tsA58原癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬增殖區(qū)獲得,是一種溫控型NSC。在體外33℃時增殖,在體內(nèi)較高溫度37℃時分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)、NT2細(xì)胞系[21](從人睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中獲得,在維甲酸的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出NSCs的特性);(5)體核細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得NSC [22]。
3.2 NSC的分離純化方法 目前建立起的NSC的分離方法有:(1)反復(fù)傳代法。取3~4個月齡的人胚胎紋狀體或孕 14~16天小鼠、大鼠胚胎大腦,機械分離制作單細(xì)胞懸液。在含多種神經(jīng)因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),實現(xiàn)NSC的體外穩(wěn)定有效擴增。經(jīng)過長期培養(yǎng)反復(fù)傳代可使NSC得到純化。(2)流式細(xì)胞術(shù)。Sasaki等[23]采用流式細(xì)胞儀對約60種細(xì)胞表面抗原進行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分選出的具有CD133+/CE34+/CD45-(細(xì)胞表面抗原)的細(xì)胞為NSC。(3)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。Keyoung [24]等利用腺病毒為載體,將置于歸巢素和Msi1增強子和啟動子控制下的綠色熒光蛋白基因?qū)肴伺咛ゼ?xì)胞,然后對胚胎細(xì)胞進行體外培養(yǎng),只有NSC能特異性地出現(xiàn)綠色熒光蛋白。再利用流式細(xì)胞儀進行熒光篩選,能進一步將NSC收集起來。(4)免疫磁珠細(xì)胞分選法。利用磁珠表面的特異性抗體與NSC表面抗原結(jié)合,在磁場作用下使結(jié)合磁珠的NSC與其他細(xì)胞分離,從而得到較純化的NSC。
3.3 NSC的鑒定 巢蛋白(Nestin)是一種神經(jīng)元中間絲蛋白[25],其表達(dá)始于神經(jīng)胚形成時,當(dāng)NSC遷移基本完成,巢蛋白的表達(dá)量逐漸減少,并隨NSC分化的完成停止表達(dá)。免疫組化證實NSC均呈Nestin陽性。Okano等[26]鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白即 Musashi ,可作為NSC的標(biāo)志物。對分離培養(yǎng)得到的NSC進行標(biāo)記時發(fā)現(xiàn),Nestin和Musashi呈雙重陽性,且隨著NSC分化成為神經(jīng)元,二者的標(biāo)記作用也消失,說明Musashi具有與Nestin相似的特異性和種間保守性。Nestin和Musashi作為早期原始神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物已被廣泛地應(yīng)用于NSC的鑒定。
4 NSC的應(yīng)用前景
4.1 NSC原位誘導(dǎo) 內(nèi)源性NSC的自身激活。大量體外和在體實驗已經(jīng)證實成年腦中存在NSC。研究影響NSC增殖和分化的信號作用的實驗[27]證實,腦室管膜下區(qū)等部位的NSC在腦損傷發(fā)生后能夠增殖、遷移到受損部位并分化成新的神經(jīng)細(xì)胞,取代受損腦組織細(xì)胞。在大多數(shù)情況下,僅由內(nèi)源性干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)組織可能不足以替代損傷后缺失的神經(jīng)組織,尤其在脊髓、紋狀體等神經(jīng)組織發(fā)生很少的部位[28]??赡茉蛴校海?)原位誘導(dǎo)出功能特異的神經(jīng)元可能需要多種刺激和特定細(xì)胞因子的作用。(2)患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞缺陷或無法激活。
4.2 異體神經(jīng)干細(xì)胞移植 臨床試驗表明,移植胎兒腦組織治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可以明顯改善癥狀。但胎腦的來源有限,受倫理和法律上的束縛,限制研究的發(fā)展。NSC的發(fā)現(xiàn)和體外分離培養(yǎng),為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代療法拓寬了道路。在體外培養(yǎng)擴增的NSC移植到腦疾病動物模型腦內(nèi)的實驗[29]表明,體外培養(yǎng)的NSC移植到腦內(nèi)后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細(xì)胞,其分化方向與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。Vescovi等[30]在研究細(xì)胞移植治療帕金森病時發(fā)現(xiàn),在體外實驗中沒有必需的因素干預(yù)下, NSC自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細(xì)胞總數(shù)的0.5%~5%。因此,誘導(dǎo)NSC向修復(fù)所需的神經(jīng)功能(目的)細(xì)胞分化成為研究的核心問題。
4.3 基因治療 基因治療是通過特定載體相關(guān)外源基因?qū)塍w內(nèi),使其獲得表達(dá),達(dá)到治療由于某種基因缺陷或突變引起的疾病。目前神經(jīng)系統(tǒng)基因治療常用的靶細(xì)胞有:(1)成纖維細(xì)胞,來自間充質(zhì),能在體外分裂增殖,具有較高的病毒感染率但植入腦后不能與宿主整合;(2)永生化神經(jīng)祖細(xì)胞,體外容易進行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和能與宿主整合等優(yōu)點,但存在致癌的危險;(3)NSC來源于神經(jīng)組織,比永生化NSC更能保持原有的生物學(xué)特性,具有分化能力和更好的組織相容性,可以整合到宿主腦組織并向周圍遷移,不形成腫瘤等。
4.4 NSC的其他應(yīng)用 NSC具有穩(wěn)定的生物學(xué)性狀,建系以后可以獲得均一的遺傳背景,具有組織和種屬特異性,可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺。利用NSC的多向分化潛能,可篩選出控制和促進NSC向終末細(xì)胞分化的藥物。另外,利用攜帶報告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染腦內(nèi)可增殖細(xì)胞來追蹤神經(jīng)前體細(xì)胞的分布、增殖分化和遷移情況,研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。