Western Blot實(shí)驗(yàn)中濾紙和膜的選擇 應(yīng)用 用法
更新時(shí)間:2012-02-01 | 點(diǎn)擊率:19974
Western Blot實(shí)驗(yàn)中濾紙及膜的選擇
Western Blot實(shí)驗(yàn)中濾紙及膜的選擇
Western Blot實(shí)驗(yàn)中濾紙使用的濾紙必須是 WHATMAN 3MM層析濾紙WHATMAN 3MM濾紙
【詳細(xì)說明】
1、NC膜、PVDF膜、尼龍膜怎樣鑒別?
解答:尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;*纖維素(NC)膜是目前應(yīng)用廣的一種固相支持物,價(jià)格便宜;PVDF膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言:尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480-600μg/cm2,可結(jié)合短至10bp的核酸片段;*纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80-100μg/cm2,對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng);PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125-300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言:尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合;*纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA,結(jié)合不牢固;PVDF膜結(jié)合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言:尼龍膜較強(qiáng);*纖維素膜較脆,易破碎;PVDF膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言:尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交,雜交后探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來;*纖維素膜不能重復(fù)使用;PVDF膜可以重復(fù)使用。
2、在做Western Blot時(shí),PVDF膜用甲醇浸泡的目的?
解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán),使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
3、檢測(cè)磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎?
解答:可以。
4、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶,為什么大分子蛋白的一端(即點(diǎn)樣的一側(cè))的轉(zhuǎn)膜不是很好?
解答:這是正常的,大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢,延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流,大分子一端就會(huì)好的多,但是小分子的就有可能會(huì)變淡。
5、膜一般要如何處理?
解答:一般用甲醇泡泡就可以了。
6、上下槽緩沖液有何要求,怎樣才能達(dá)到佳效果。
解答:無要求。
7、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢?是有的成分不對(duì)嗎?
解答:沒什么問題,就是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來,在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了。如果過夜,膠里的水分被蒸發(fā),采用保鮮膜包上也可以;也可能母液(30%聚丙酰胺)有問題,可以重新配制一份觀察;能夠替換的試劑,盡量換一下,選用好的試劑,避免找麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會(huì)造成膠縮。
8、膜、濾紙、膠大小有何講究?
解答:如果是用的是半干轉(zhuǎn),順序?yàn)椋宏帢O-濾紙-膠-膜-濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬比膠的長(zhǎng)寬小1-2mm,而膜的長(zhǎng)寬分別比膠的長(zhǎng)寬大1-2mm。禁忌:上下兩層濾紙因?yàn)檫^大而相互接觸,這樣會(huì)短路,電流不會(huì)通過膠和濾紙。
9、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,如要分離小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好嗎?
解答:這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移,一般建議:21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn),12%SDS-PAGE,濕轉(zhuǎn)36V,3-5hrs就可以了, 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié);170kd 用7%SDS-PAGE, 48V 10hrs-16hrs。
10、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上,轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決?
解答:可以考慮:轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液,可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》),因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率,但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間;轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率;用的轉(zhuǎn)移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯(lián);低濃度膠,如低至6%。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉(zhuǎn)移電壓/電流;增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。
11、如何選擇合適的蛋白雜交膜?
解答:蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素,我們要量體裁衣,從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。
*纖維素膜:*纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下,大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與*纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起,雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚,但由于*纖維素膜的這個(gè)特性,而且易于封閉非特異性結(jié)合,從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下,結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小,要選擇不同孔徑的*纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小,膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1μm,蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此,我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的*纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,如果用0.45μm的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthroμgh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看,重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。*纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的*纖維素的純度有關(guān),市場(chǎng)上有些*纖維素膜通常會(huì)有大量的醋酸纖維素,因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的*纖維素,保證了大的蛋白結(jié)合量,可達(dá)80-150μg/cm2。由于100%的純度,因而也大大減少了非特異性的結(jié)合,降低雜交背景,無需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次,膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的*纖維素膜比較脆,漂洗一兩次就會(huì)破損,不能反復(fù)使用。
PVDF轉(zhuǎn)移膜:PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì),通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì),而且可以分離小片段的蛋白質(zhì),初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測(cè)定,因?yàn)?纖維素膜在Edman試劑中會(huì)降解,所以就尋找了PVDF作為替代品,雖然PVDF膜結(jié)合蛋白的效率沒有*纖維素膜高,但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品,一直沿用至今。PVDF膜與*纖維素膜一樣,可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè),也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜,靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高,非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉(zhuǎn)移膜:*纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的,還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán),包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下,DEAE基團(tuán)都能帶電荷,在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜,除了可以做Western Blotting外,還可以用于核酸結(jié)合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基(CM)修飾的纖維素膜,它可以結(jié)合蛋白和多肽分子,以及其他的一些帶正電荷的樣品,適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來,用于氨基酸系列分析或微測(cè)序。
雜交膜轉(zhuǎn)印膜*纖維素膜NC膜與PVDF膜的區(qū)別
雜交膜轉(zhuǎn)印膜*纖維素膜NC膜與PVDF膜的區(qū)別
1. *纖維素膜
*纖維素膜是蛋白印跡廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì),對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力,而且適用于各種顯色方法,包括同位素,化學(xué)發(fā)光(Luminol類)、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色;背景低,信噪比高。NC膜的使用也很簡(jiǎn)便,比如不需要甲醛預(yù)處理,只要在無離子水面浸潤(rùn)排出膜內(nèi)氣泡,再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了;比如NC膜很容易封閉,也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間,不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆,又容易卷,操作要小心,不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途--因?yàn)榻?jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇合適的孔徑,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜,小于20KD的話建議選擇0.2um的,如果小于7KD的話好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜--混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結(jié)合力會(huì)有所降低。另外提醒一句:由于NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮妫虼嗽诜忾]時(shí)好使用較溫和的Tween20,而且濃度不要超過0.3%(據(jù)說0.05%效果好)。一般而言,NC膜越純,其蛋白結(jié)合能力就越高,所以要增加WB的靈敏度和分辨率,提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素--這在前面已經(jīng)提到,會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜,比較脆,機(jī)械耐受力欠佳,需要小心操作,如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”,那么就可以考慮一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著稱的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是實(shí)惠的選擇,只不過要自己動(dòng)手裁剪--切記,必須帶手套操作。
*纖維素膜生產(chǎn)商:
*纖維素膜生產(chǎn)商:
GE WHATMAN BA83 BA85 價(jià)格 1950.00/卷 有現(xiàn)貨
GE RPN303C
PALL 66485 常用的NC膜 30cm*3m/卷超低*:1250.00/卷現(xiàn)貨
2. PVDF膜
與*纖維素膜相比,PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力,機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更*的性能。市售*纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2(而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍!)。但是PVDF膜大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此:更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測(cè)中成為理想選擇;而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的,特別是需要做N端蛋白測(cè)序,在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下,當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色,笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測(cè)序的*選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡,才能用,而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理(不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁,誰要你不小心呢,轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了,轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)別呢)。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的,后者孔徑小,對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附,背景可能會(huì)比前者稍高。
pvdf膜生產(chǎn)商:
pvdf膜生產(chǎn)商:
MILLIPORE * 常年 現(xiàn)貨
IPVH00010 0.45um 1650.00/卷
ISEQ00010 0.22um 2050.00/卷
PALL 66543 2150.00/卷
卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,裁剪剩下的邊角料還可以用來做點(diǎn)雜交。再次強(qiáng)調(diào)的是,疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘,待膜變成半透明后用純水漂洗一下,轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用
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