看完這些你就知道什么是TEV蛋白酶了
更新時間:2021-08-05 | 點擊率:3870
TEV蛋白酶是來源于煙草蝕紋病毒的nla蛋白酶中27kda的活性結(jié)構(gòu)域,其氨基酸序列。tev蛋白酶具有很強的位點特異性,能夠識別exxyxq(g/s)七氨基酸序列,常用序列的是glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly(或enlyfqg),其切割位點在谷氨酰胺gln(p1)和甘氨酸gly(p1′)之間(即p1和p1’之間),其序列專一性遠(yuǎn)比凝血酶、因子xa、腸激酶等蛋白酶高。
tev蛋白酶能夠耐受范圍廣泛的ph(ph4-8.5)和溫度(4-34℃),對一些常見的增加蛋白可溶性或穩(wěn)定性的添加劑(乙二醇、egta、去垢劑以及還原劑)也都有不同程度的耐受。
有研究證明,tev蛋白酶對乙二醇、egta和一些除垢劑(tritonx-100、tween-20和np-40)不敏感,當(dāng)1%chaps存在時活性降低,在低濃度變性劑(2m尿素,1%sds)和還原劑(0.7mβ-巰基乙醇)中依舊可以保持大部分活性(c.sunetal.,2012)。
野生型tev酶在表達(dá)和溶解性等方面存在一定的缺陷,所以通過基因工程技術(shù)改良的突變體有大量報道。例如,天然的tev蛋白酶會發(fā)生自我切割,在表達(dá)和純化過程中,它會不斷由于其它tev蛋白酶的碰撞而發(fā)生構(gòu)象變化,在特定位點發(fā)生自我切割,從而使完整的蛋白酶被截短,活性大大降低。
lucast等人找到的s219n突變體,穩(wěn)定性得到很大的提高,但是可溶性并不高,有大約95%的蛋白是以包涵體的形式存在于沉淀中。kapust等人使用基因工程點突變了天然tev蛋白酶的基因序列,得到s219v這一穩(wěn)定性較高并且酶活性也有稍微提高的突變體,其穩(wěn)定性比s219n要高出約100倍。
其次,tev蛋白酶表達(dá)產(chǎn)量不高,溶解度也非常低。大約只有5%的tev蛋白酶存在于細(xì)胞破碎液的上清中,產(chǎn)量為12.5mg/l。
vandenberg等人通過基因改組(dnashuffling)、易錯pcr(error-pronepcr)發(fā)現(xiàn)了一種可以將產(chǎn)量提高到54mg/l的突變體tevsh,其溶解度比s219n有很大提高,并且酶活性變化不大。cabrita,l.d.等人使用popmusic軟件設(shè)計,對tev蛋白酶單點突變體進行穩(wěn)定性分析,篩選出了五個突變體,它們的可溶性和酶活性相對于野生型tev蛋白酶都得到提升,同時還得到一個雙突變體,其可溶性及酶活性相對于單突變體有顯著提高。
針對tev蛋白酶本身的缺點,研究者一直在尋找改良的突變體。例如,tevser135gly突變體比wt更穩(wěn)定,可以耐受對更高的溫度(>40℃);還有一些突變(t17s,n68d,n177v)可以顯著提高tev蛋白酶的溶解性。
上一篇: 使用組織膠水時有哪些注意事項呢?看看這些