乳酸脫氫酶（LDH）測試盒 微量酶標儀法 說明 技術 文章

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乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒

商品貨號：MS1001
英文名稱：Micro Lacate Dehydrogenase（LDH）Assay Kit
別名：乳酸脫氫酶試劑盒 LDH Kit 乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒 乳酸脫氫酶（LDH）測試盒
檢測方法：微量法

• 產品詳細介紹
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• 產品說明書

測定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，伴隨著NAD+/NADH之間互變。

測定原理：

LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

貨號：MS1001                                                     規(guī)格：100管/48樣

乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。

測定原理：

LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體5mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入1.3 mL蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑

        分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：液體5 mL×1瓶，4℃避光保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至450nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴15min

充分混勻，室溫靜置15min， 450 nm下測定吸光度，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設一個對照管。

LDH活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.725x   (x為標準品濃度，μmol/mL；y為對吸光度)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=ΔA÷0.725÷T×10³=92×ΔA

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =92×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =92×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.046×ΔA

V1：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細胞或細菌總數，2000萬；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.3625x   (x為標準品濃度，μmol/mL；y為對吸光度)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=ΔA÷0.3625÷T×10³=184×ΔA

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA÷0.3625×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =184×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA÷0.3625×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =184×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（nmol/min/10⁴ cell）= [ΔA÷0.3625×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×10³ =0.092×ΔA

V1：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細胞或細菌總數，2000萬；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。