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蛋白電泳 SDS-PAGE及WESTERN BLOT

更新時間:2017-10-10  |  點擊率:5859

蛋白電泳 SDS-PAGE原理

SDS是一種陰離子表面活性劑,能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵,并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此,各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時的遷移率,不再受原有電荷和分子形狀的影響,而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)。實驗使用過程中,還加入DTT或者巰基乙醇,以打開蛋白間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。SDS—PAGE常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)(分離膠與濃縮膠)。

一、樣品制備

本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液,每款裂解液會配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。

  • 實驗試劑
  • 蛋白提取
  • 蛋白定量
產(chǎn)品貨號產(chǎn)品名稱
R0010RIPA_
R0020普通RIPA
R0030非變性組織細(xì)胞裂解液
A8260Aprotinin 蛋白酶抑制劑(抑肽酶)
P8100Pepstatin A 胃蛋白酶抑制劑
P1260(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
T8031Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制劑
P1260(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
539133Protease Inhibitor Cocktail Set VI
539134Protease Inhibitor Cocktail Set III
PC0030Lowry法蛋白濃度測定試劑盒
PC0010Bradford蛋白濃度測定試劑盒>
PC0020BCA蛋白濃度測定試劑盒

二、蛋白電泳

 

  • 實驗試劑
  • 預(yù)制膠
  • 制膠
  • 上樣及電泳
  • 染色

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案,實驗室可根據(jù)自己的情況和習(xí)慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。

系號產(chǎn)品貨號產(chǎn)品名稱系號產(chǎn)品貨號產(chǎn)品名稱
1T8060TRIS 三羥甲基氨基甲烷11S10514XSDS-PAGE分離膠緩沖液(PH=8.8)
2G8200Glycine 甘氨酸12S10524XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液(PH=6.8)
3S8010SDS 十二烷基硫酸鈉13P10164×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)
4A8080Acrylamide 丙烯酰胺14P10154×蛋白上樣緩沖液(含DTT)
5M8200N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺15D10701M DTT
6A8090Ammonium Persulfate 過硫酸胺16A103010%過硫酸氨
7D8220DTT 二硫蘇糖醇17T10201M Tris-HCL (PH6.8)
8M8210β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇18T10101.5M Tris-HCL(PH8.8)
9T8090TEMED 四甲基乙二胺19S101010%SDS
10A101030%丙烯酰胺(29:1)20T10705×Tris-甘氨酸電泳緩沖液

三、WESTERN BLOT

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,此技術(shù)稱為免疫印跡(Western blot)。Western blotting檢測系統(tǒng)除需要過氧化物酶標(biāo)記的各種二抗外,還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學(xué)發(fā)光兩種試劑及相應(yīng)試劑盒。

  • 轉(zhuǎn)膜
  • 顯色

Millipore和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜,具有0.22um和0.45um兩種規(guī)格。 轉(zhuǎn)膜后還可以用P0012(10×麗春紅)檢測轉(zhuǎn)膜效果,尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節(jié)省成本和時間,您可以選擇本公司的SW3020(Western Blot膜再生液)對用過的膜進(jìn)行清洗,隨后,可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪Western Blot實驗。 膜再生液實質(zhì)是在不影響膜上結(jié)合的抗原的條件下將抗體洗脫下來,實際操作中,膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意:適用于 ECL和類似的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western 檢測。不適用于非化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western檢測,例如DAB,NBT/BCIP。

產(chǎn)品貨號產(chǎn)品名稱
P001210×麗春紅
SW3010膜封閉液
A1800抗體稀釋液
A1810一抗稀釋液
A1820HRP標(biāo)記抗體稀釋液
A1830AP標(biāo)記抗體稀釋液
A1840熒光抗體稀釋液
T10851×TBST

實驗操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。

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