蛋白質(zhì)含量測定法

蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中常用、基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時間。
    folin—酚試劑法早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng),而且對后者的影響還要大得多?？捡R斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用. 索萊寶公司提供的Bradford 蛋白濃度測定試劑盒可以用于蛋白質(zhì)含量測定，簡單快速。

Bradford 蛋白濃度測定試劑盒 
貨號：PC0010 
規(guī)格：2500T 
保存：開封使用后請密封保存，本試劑盒自訂購之日起九個月內(nèi)有效。 
產(chǎn)品內(nèi)容： 
    組成  包裝（2500微孔)  保存   
    5×G250 染色液  100ml  2-8℃   
    PBS稀釋液  30ml  2-8℃   
    蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA)  1ml  -20℃ 
產(chǎn)品簡介： 
  考馬斯亮蘭G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的大吸收峰的位置（Imax），由 465nm變?yōu)?595nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測定的吸光度值 A595 與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中巰基乙醇的濃度可高達 1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達 5mM，但受略高濃度的去垢劑影響，需確保 SDS 的濃度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產(chǎn)的 BCA蛋白濃度測定試劑盒。 
操作說明：操作說明： 
  一．微孔酶標(biāo)儀法 
 1.  *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10ul，稀釋至 250ul ，使終濃度為 0.2mg/ml。待測蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 
 2. 5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 雙蒸水，混勻成 1×G250染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
 3.  將標(biāo)準(zhǔn)品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中，加 PBS 稀釋液補足到 20 微升。 
 4.  將樣品作適當(dāng)稀釋（好多做幾個梯度，如作2 倍、4 倍、8 倍稀釋），加 20 微升到96 孔板的樣品孔
中。由于移液器在取小量時的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2 后。  
 5.  各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250染色液，室溫放置 3-5 分鐘。 
 6.  用酶標(biāo)儀測定 A595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度。 
 7.  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度。 
 二．分光光度計法 
  如無酶標(biāo)儀，染色反應(yīng)可在離心管中進行，反應(yīng)液混勻后加入比色皿中，使用分光光度計測定吸光值。 
步驟如下： 
   1.  取八支（或者更多）干凈的 10ml 離心管，標(biāo)記上號。 
   2.  取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml。 
  3.  5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 雙蒸水，混勻成 1×G250 染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
4.  按下表加入試劑(以每孔 5ml 計，多余的用來清洗比色皿) 
離心管號  1  2  3  4  5  6  7（樣品管 1） 8（樣品管 2）   9（樣品管 3）
標(biāo)準(zhǔn)蛋白 BSA  0ul  100ul  200ul  300ul 400ul 500ul 500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 1 
500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 2 
…… 
PBS  500ul  400ul  300ul  200ul 100ul 0ul  0ul  0ul   0ul 
1XG250 染色液  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml 
5.  反應(yīng) 3 分鐘后測 OD 值。為了實驗的準(zhǔn)確性，可每間隔 2 分鐘加一管染色液，每間隔 2 分鐘測一管 OD
值。如下表： 
離心管號  1  2  3  4  5  6  7  8  …… 
加染色液（分鐘）  0  2  4  6  8  10  12  14  …… 
測 OD值  3  5  7  9  11  13  15  17  …… 
考馬斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。