蛋白質(zhì)含量測定法
蛋白質(zhì)含量測定法,是生物化學(xué)研究中常用、基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法,即定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法,即考馬斯亮藍法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法靈敏度高,比紫外吸收法靈敏10~20倍,定氮法雖然比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是,這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì),因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定,有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是無缺的,都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮:①實驗對測定所要求的靈敏度和度;②蛋白質(zhì)的性質(zhì);③溶液中存在的干擾物質(zhì);④測定所要花費的時間。
folin—酚試劑法早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要控制操作時間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾lowry反應(yīng),而且對后者的影響還要大得多??捡R斯亮藍法(Bradford法),由于其突出的優(yōu)點,正得到越來越廣泛的應(yīng)用. 索萊寶公司提供的Bradford 蛋白濃度測定試劑盒可以用于蛋白質(zhì)含量測定,簡單快速。
Bradford 蛋白濃度測定試劑盒
貨號:PC0010
規(guī)格:2500T
保存:開封使用后請密封保存,本試劑盒自訂購之日起九個月內(nèi)有效。
產(chǎn)品內(nèi)容:
組成 包裝(2500微孔) 保存
5×G250 染色液 100ml 2-8℃
PBS稀釋液 30ml 2-8℃
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA) 1ml -20℃
產(chǎn)品簡介:
考馬斯亮蘭G-250 染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的大吸收峰的位置(Imax),由 465nm變?yōu)?595nm,在一定的濃度范圍內(nèi),測定的吸光度值 A595 與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響,樣品中巰基乙醇的濃度可高達 1M,二硫蘇糖醇的濃度可高達 5mM,但受略高濃度的去垢劑影響,需確保 SDS 的濃度低于 0.1%,Triton X-100 低于 0.1%,Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用索萊寶生產(chǎn)的 BCA蛋白濃度測定試劑盒。
操作說明:操作說明:
一.微孔酶標(biāo)儀法
1. *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,取 10ul,稀釋至 250ul ,使終濃度為 0.2mg/ml。待測蛋白樣品在什么溶液中,標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見,也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻,取 1ml 5×G250 染色液,加入 4ml 雙蒸水,混勻成 1×G250染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分別加到 96 孔板中,加 PBS 稀釋液補足到 20 微升。
4. 將樣品作適當(dāng)稀釋(好多做幾個梯度,如作2 倍、4 倍、8 倍稀釋),加 20 微升到96 孔板的樣品孔
中。由于移液器在取小量時的誤差,標(biāo)準(zhǔn)線前面的點可能不很準(zhǔn)確,所以盡可能的讓樣品點落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2 后。
5. 各孔加入 200 微升稀釋后的 1×G250染色液,室溫放置 3-5 分鐘。
6. 用酶標(biāo)儀測定 A595,或560-610nm之間的其它波長的吸光度。
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度。
二.分光光度計法
如無酶標(biāo)儀,染色反應(yīng)可在離心管中進行,反應(yīng)液混勻后加入比色皿中,使用分光光度計測定吸光值。
步驟如下:
1. 取八支(或者更多)干凈的 10ml 離心管,標(biāo)記上號。
2. 取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀釋至終濃度為 0.2mg/ml。
3. 5×G250 染色液使用前請顛倒 3-5 次混勻,取 10ml 5×G250 染色液,加入 40ml 雙蒸水,混勻成 1×G250 染色液,此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。
4. 按下表加入試劑(以每孔 5ml 計,多余的用來清洗比色皿)
離心管號 1 2 3 4 5 6 7(樣品管 1) 8(樣品管 2) 9(樣品管 3)
標(biāo)準(zhǔn)蛋白 BSA 0ul 100ul 200ul 300ul 400ul 500ul 500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 1
500ul 適當(dāng)稀
釋的樣品 2
……
PBS 500ul 400ul 300ul 200ul 100ul 0ul 0ul 0ul 0ul
1XG250 染色液 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
5. 反應(yīng) 3 分鐘后測 OD 值。為了實驗的準(zhǔn)確性,可每間隔 2 分鐘加一管染色液,每間隔 2 分鐘測一管 OD
值。如下表:
離心管號 1 2 3 4 5 6 7 8 ……
加染色液(分鐘) 0 2 4 6 8 10 12 14 ……
測 OD值 3 5 7 9 11 13 15 17 ……
考馬斯亮藍法(Bradford法),由于其突出的優(yōu)點,正得到越來越廣泛的應(yīng)用。