透析袋的選擇和使用方法
透析袋簡(jiǎn)介
透析技術(shù)自Thomas Graham 于1861年發(fā)明到現(xiàn)在已有一百多年的歷史,它已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)便,常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過(guò)程中,去除鹽、少量有機(jī)溶劑、小分子雜質(zhì)、樣品濃縮和改變微量樣品的緩沖系統(tǒng)等都要用到透析技術(shù)。
生物樣品的透析只需使用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀,將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi),浸入水或緩沖液中,樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi),而鹽和小分子等物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外,直到袋內(nèi)、外兩邊的濃度達(dá)到平衡。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”,袋(膜)外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。
透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓,擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的溶質(zhì)濃度梯度形成的。透析的速度同欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度、膜的面積和溫度成正比,與膜的厚度成反比。升高溫度可加快透析速度。為大限度地保持生物大分子的活性,通常采用4℃透析。
透析膜可用動(dòng)物膜和玻璃紙等,但用的多的還是用纖維素制成的透析膜。目前較常用的是美國(guó)Union Carbide (聯(lián)合碳化物公司)和美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析管,其截留分子量MwCO(即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的小分子量,縮寫為MwCO)通常從700到數(shù)萬(wàn)不等。
商品化的透析袋可制成管狀,其扁平寬度為6~50 mm不等。為防干裂,出廠前一般都經(jīng)10%的甘油處理,透析袋中含有微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì),它們對(duì)蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害,用前必須除去。新購(gòu)進(jìn)的透析袋必須經(jīng)過(guò)處理才能使用。50%的乙醇煮沸1小時(shí),再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和0.001 mol/L EDTA溶液洗滌,再用蒸餾水沖洗后即可使用。實(shí)驗(yàn)證明,50%乙醇處理對(duì)除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。使用后的透析袋洗凈后可存于蒸餾水中,置4℃保存。若長(zhǎng)時(shí)間不用,可加入適量的疊氮鈉(NaN2),以抑制微生物的生長(zhǎng)。干的透析袋彎折時(shí)易出現(xiàn)裂口,用時(shí)必須仔細(xì)檢查。
經(jīng)過(guò)處理的透析袋,使用時(shí),一端用橡皮筋或線繩扎緊,也可以使用特制的透析袋夾夾緊,由另一端灌滿蒸餾水,用手指稍加壓,檢查是否漏液,確證無(wú)誤后,再用蒸餾水洗凈,方可裝入待透析樣品。裝入樣品時(shí)通常要留三分之一至一半的空間,以防透析過(guò)程中,因透析樣品中的小分子濃度較大,袋外的水和緩沖液過(guò)量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析經(jīng)過(guò)一夜時(shí),體積增加是正常的,有時(shí)甚至可達(dá)50%以上。透析可以使用燒杯、量筒和塑料桶等容器,容器的大小以20-50:1為宜。少量樣品溶液的透析,可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下。
通常為了把握透析效果,有時(shí)需要對(duì)透析液中欲去除的小分子殘留物進(jìn)行分析,如甘氨酸、二甲基甲酰胺、甲醛、戊二醛、碳酸根、偶聯(lián)劑等。小分子殘留物的檢測(cè)分析方法很多,如 (NH4)2SO4可用1%的BaCl2檢查,NaCl、KCl等可用1%的AgNO3 檢查。有些檢測(cè)方法比較復(fù)雜,或需要一定的條件,如確有必要可參考相關(guān)文獻(xiàn)資料。
為了加快透析速度,提高透析效率,除及時(shí)更換透析液外,還可使用磁力攪拌,還可以使用各種透析裝置。
一、普通干型透析袋(美國(guó)聯(lián)合碳化Viskase,甘油涂層,使用前需處理)
技術(shù)參數(shù):
△PH穩(wěn)定范圍 : 5-9
△污染物水平: 硫化物<0.3%; 重金屬<50ppm
△化學(xué)兼容性: 與很多鹽兼容,比如CaCl2, (NH4)2SO4;還可與分子生物學(xué)及酶學(xué)中常用的水溶劑、有機(jī)溶劑兼容,比如異丙醇、乙醇和丙酮。
△溫度抵抗性:可煮沸,可高壓滅菌。
△蛋白吸附: 每克透析袋吸附蛋白量小于1ng
儲(chǔ)存條件:
透析袋可存放于10-29度;每次使用后將余下的膜放回袋子并密封好,以防干裂。
透析袋使用前處理方法:
1. 把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的小段。
2. 在大體積的2%(W/V)碳酸氫鈉和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。
3. 用蒸餾水*清洗透析袋。
4. 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將之煮沸10分鐘。
5. 冷卻后,存放于4度,必須確保透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋是必須戴手套。
6. 用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出,將之清洗干凈。
7.實(shí)驗(yàn)要求不高的可以用簡(jiǎn)易處理方法:在沸水中煮10min即可使用。
二、透析袋的區(qū)別 |
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| 纖維素透析袋 | 再生纖維素透析袋 | 普通型透析袋 |
分子量 | 100-500,500-1000,5k,10k,20k,50k,100k,300k | 1k,2k,3.5k,8k,10k,25k,50k | 3.5k,7k,8-14k |
化學(xué)兼容性 | 適用于:甲醇,乙醇和異丙醇等低碳醇(短時(shí)間、低濃度)。不適用于:強(qiáng)極性溶劑(如丙酮,甲乙酮,二惡烷) | 適用于:烴,鹵代烴,醇,酮,酯,氧化物,含氮溶劑。不適用于:鹽酸(濃度>25%),硝酸(濃度>25%),96%硫酸,25%高氯酸,1N氫氧化鉀和10%的苯酚水溶液。 | 與很多鹽兼容,比如CaCl2、(NH4)2SO4,還可與分子生物學(xué)和酶學(xué)常用的水溶劑和有機(jī)溶劑兼容,如異丙醇、乙醇、丙酮。 |
有機(jī)抗性 | 中等 | 好 | 好 |
污染物水平 | 不含重金屬和硫化物 | 不含重金屬和硫化物 | 硫化物<0.3%,重金屬<50ppm |
包裝 | 濕型,0.05%* | 濕型,0.05%* | 干型 |
扁平寬度 | 10,16,24,31mm | 10,12,18,24,28,38,45,50,53mm | 25,34,44,77mm |
PH范圍 | 2-9 | 2-12 | 5-9 |
溫度限度 | 37℃ | 60℃ | 可煮沸,可高壓滅菌 |
預(yù)處理 | 無(wú)需預(yù)處理,只需用蒸餾水清洗即可使用 | 無(wú)需預(yù)處理,只需用蒸餾水清洗即可使用 | 在沸水或 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10分鐘 |
三、透析袋應(yīng)用:
去除鹽類,表面活性劑和溶劑
樣品溶液的緩沖液置換和PH值的調(diào)節(jié)
濃縮蛋白質(zhì),多肽和抗體
DNA電洗脫
電泳前稀釋蛋白的制備
小分子污染物清除
結(jié)合研究
組織培養(yǎng)的提取純化
四、透析袋的選擇:
(1)正確選擇合適的截留分子量
截留分子量的選擇是以預(yù)留在膜內(nèi)的大分子的分子量和將要被除去的小分子污染物的分子量為基礎(chǔ)的。為達(dá)到合理有效的分離,需分離的兩種物質(zhì)分子量的比率至少為25.
選擇截留分子量的經(jīng)驗(yàn)法則:選擇截留分子量值約為要保留的大分子分子量的一半,以獲得至少90%的保留率。
(2)正確選擇扁平寬度
透析袋扁平寬度的選擇取決于樣品體積和透析容量。較小的透析管透析更快;較大的透析管因擴(kuò)散距離較長(zhǎng)透析較慢。為易于使用,建議使用總長(zhǎng)(包括閉合夾和頂部空間)為大約10-15厘米的透析袋
(3)透析袋的化學(xué)相容性
化學(xué)相容性主要用作使用指導(dǎo),不作為化學(xué)相容的保證。溫度,濃度,長(zhǎng)時(shí)間曝光等因素的改變可能影響產(chǎn)品的使用。建議您自設(shè)條件進(jìn)行測(cè)試。
五、透析袋的使用:
下述透析程序是一個(gè)普遍的基礎(chǔ)透析過(guò)程。在開(kāi)始透析之前應(yīng)考慮到許多變數(shù)。透析樣品溶劑、膜的化學(xué)相容性、膜的截留分子量,透析溶劑、透析體積、溫度等變量都會(huì)影響透析速率,因此,一些應(yīng)用中下述透析過(guò)程可能需要適當(dāng)?shù)淖兓?/span>
1. 把適量的透析液(緩沖液)加入透析裝置。透析液的體積應(yīng)為樣品體積量的100倍。(例如:在一升透析液中透析10毫升的樣品)
2. 裁剪適當(dāng)長(zhǎng)度的透析管。預(yù)留一段額外長(zhǎng)度(約占總樣品體積量的20%)作為頭部空間。
3. 把透析管插入打開(kāi)的透析夾,在約超出透析夾3-5毫米的位置再夾住。不要折疊透析袋。
4. 由透析管開(kāi)口端將樣品裝入。調(diào)整一下頂部空間的長(zhǎng)度,夾緊透析夾。
5. 把透析樣品放在合適的透析緩沖液中。
6. 透析要根據(jù)具體的應(yīng)用需求。通常情況下,允許經(jīng)過(guò)一夜透析。在持續(xù)透析的過(guò)程中,至少要進(jìn)行3次全部更換透析液。建議在(透析后)2-4小時(shí),6-8小時(shí)和10-14小時(shí)(第2天早 晨)更換透析液。在后一次透析液的更換后要至少繼續(xù)進(jìn)行2小時(shí)的透析。
注:對(duì)于高濃度污染物,樣品可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間透析,透析液需要更頻繁的更換。
7. 透析溫度主要取決于樣品。溫度限制主要取決于膜的類型。纖維素透析袋可以承受的溫度高達(dá)37℃,再生纖維素透析袋可以承受的溫度高達(dá)60℃。